RNA untai ganda (dsRNA) ELISA KIT
Kit iki minangka Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) sing digandhengake karo sistem biotin-Streptavidin, kanggo pangukuran kuantitatif dsRNA kanthi dawane luwih saka 60 pasangan basa(bp), preduli saka urutane.Piring kasebut wis dilapisi karo antibodi anti-dsRNA.dsRNA sing ana ing sampel ditambahake lan diikat karo antibodi sing dilapisi ing sumur.Banjur antibodi anti-dsRNA biotinilasi ditambahake lan diikat menyang dsRNA ing sampel.Sawise ngumbah, HRP-Streptavidin ditambahake lan diikat menyang antibodi anti-dsRNA Biotinilasi.Sawise inkubasi unbound HRP-Streptavidin wis sakabeheng adoh.Banjur solusi substrat TMB ditambahake lan dikatalisis dening HRP kanggo ngasilake produk warna biru sing malih dadi kuning sawise nambahake solusi stop asam.Kapadhetan kuning sebanding karo jumlah target dsRNA sing dijupuk ing piring.Penyerapan diukur ing 450 nm.
Aplikasi
Kit iki kanggo pangukuran kuantitatif saka sisa dsRNA.
Komponen kit
|
| Komponen | HCP0033A-1 | HCP0033A-2 |
| 1 | Elisa Microplate Kab | 8×6 | 8× 12 |
| 2 | Antibodi Deteksi Biotinilasi (100x) | 60 μL | 120 μL |
| 3 | Hrp-Streptavidin (100x) | 60 μL | 120 μL |
| 4 | Buffer pengenceran | 15 ml | 30 ml |
| 5 | Solusi Substrat Tmb | 6 mL | 12 ml |
| 6 | Stop Solusi | 3 ml | 6 mL |
| 7 | Buffer Cuci Konsentrat (20x) | 20 ml | 40 ml |
| 8 | Standar (UTP, 5ng/μL) | 7,5 μL | 15 μL |
| 9 | Standar (pUTP, 5ng/μL) | 7,5 μL | 15 μL |
| 10 | Standar (N1-Me-pUTP, 5ng/μL) | 7,5 μL | 15 μL |
| 11 | Standar (5-OMe-UTP, 5ng/μL) | 7,5 μL | 15 μL |
| 12 | STE Buffer | 25 ml | 50 ml |
| 13 | Plate Sealer | 2 bêsik | 4 bêsik |
| 14 | Instruksi Manual lan COA | 1 salinan | 1 salinan |
Panyimpenan lan Stabilitas
1. Kanggo kit sing ora digunakake: Kabèh kit bisa disimpen ing 2 ~ 8 ℃ ing urip beting.Cahya sing kuwat kudu dihindari kanggo stabilitas panyimpenan.
2. Kanggo kit sing digunakake: Sawise microplate dibukak, tutup sumur sing ora digunakake karo piring sealer lan bali menyang kantong foil sing ngemot paket desiccant, segel zip kantong foil lan bali menyang 2 ~ 8 ℃ sanalika bisa sawise digunakake.Reagen liyane kudu bali menyang 2 ~ 8 ℃ sanalika bisa sawise digunakake.
Bahan sing Dibutuhake Nanging Ora Disedhiyakake
1. Microplate maca karo 450 ± 10nm Filter (luwih apik yen bisa ndeteksi ing 450 lan 650 nm dawa gelombang).
2. Microplate shaker.
3. tips RNase-free lan tabung centrifuge.
Flowchart Operasi
Sadurunge Sampeyan Miwiti
1. Nggawa kabeh komponen kit lan conto kanggo suhu kamar (18-25 ℃) sadurunge digunakake.Yen kit ora bakal digunakake munggah ing siji wektu, mangga mung njupuk metu ngudani lan reagen kanggo eksperimen saiki, lan ninggalake ngudani isih lan reagen ing kondisi sing dibutuhake.
2. Wash buffer: dilute 40mL saka 20 × klempakan wash buffer karo 760mL saka deionized utawa banyu suling kanggo nyiyapake 800mL saka 1 × wisuh buffer.
3. Standar: muter sedhela utawa centrifuge solusi Simpenan sadurunge digunakake.Konsentrasi papat standar sing diwenehake yaiku 5ng / μL.Kanggo standar UTP lan pUTP dsRNA, mangga diencerake solusi stok dadi 1,0.5,0.25,0.125,0.0625,0.0312,0.0156,0pg/μL kanthi buffer STE kanggo nggambar kurva standar.Kanggo standar dsRNA N1-Me-pUTP, mangga diencerke solusi stok dadi 2,1,0.5,0.25,0.125,0.0625,0.0312, 0pg/μL karo buffer STE kanggo nggambar kurva standar.Kanggo standar dsRNA 5-OMe-UTP, mangga diencerake solusi stok dadi 4,2,1,0,5, 0,25,0,125,0,0625, 0pg/μL karo buffer STE kanggo nggambar kurva standar.Disaranake standar bisa diencerke minangka grafik ing ngisor iki:
|
N1-Me-pUTP dsRNA standar | |||
|
Ora. |
Konco Pamungkas (pg/mL) | instruksi ngencerake | |
| STE panyangga |
standar | ||
|
A
B C D E F G H | 100
2
1 0.5 0.25 0. 125 0,0625 0.0312 0 | 49 μl
490 μL
250 μL 250 μL 250 μL 250 μL 250 μL 250 μL 250 μL | 1μL 5ng/μL standar 10 μL 100 pg / μL solusi 250 μL solusi A 250 μL solusi B 250 μL larutan C 250 μL solusi D 250 μL solusi E 250 μL solusi F / |
| Kanggo standar dsRNA 5-OMe-UTP | |||
|
Ora. |
Konco Pamungkas (pg/mL) | instruksi ngencerake | |
| STE panyangga |
standar | ||
|
A
B C D E F G H |
100
4
2 1 0.5 0.25 0. 125 0,0625 0 |
49 μl
480 μL
250 μL 250 μL 250 μL 250 μL 250 μL 250 μL 250 μL | 1μL 5ng/μL standar 20 μL 100 pg / μL solusi 250 μL solusi A 250 μL solusi B 250 μL larutan C 250 μL solusi D 250 μL solusi E 250 μL solusi F / |
4. Antibodi deteksi biotinilasi lan solusi kerja HRP-streptavidin: muter sedhela utawa centrifuge solusi saham sadurunge digunakake.Dilute menyang konsentrasi kerja kanthi buffer dilution.
5. Substate TMB: nyedhot dosis solusi sing dibutuhake kanthi tips sing wis disteril lan aja mbucal solusi ampas menyang vial maneh.Substate TMB sensitif marang cahya, aja nganti cahya substrat TMB nganti suwe.
Nggunakake protokol
1. Nemtokake nomer ngudani dibutuhake kanggo assay.Lebokake strip ing pigura kanggo digunakake.Strip piring sing isih ora digunakake ing tes iki kudu dibungkus maneh ing tas nganggo desiccant.Nutup tas kanthi tightly kanggo panyimpenan ing kulkas.
2. Tambah 100μL saben pengenceran standar, kosong lan conto menyang sumur sing cocog.Tutup nganggo piring sealer.Inkubasi 1 jam ing suhu kamar kanthi goyang ing 500rpm.Sampel kudu diencerke karo buffer STE kanggo konsentrasi sing cocog kanggo tes akurat.
3. Langkah ngumbah: Aspirate solusi lan wisuh karo 250μL wisuh buffer kanggo saben sumur lan supaya ngadeg kanggo 30s.Buang buffer wash rampung kanthi nyelehake piring ing kertas penyerap.Sakabehe wisuh 4 kaping.
4. Tambah 100μL solusi kerja antibodi deteksi biotinilasi menyang saben sumur.Tutup nganggo piring sealer.Inkubasi 1 jam ing suhu kamar kanthi goyang ing 500rpm.
5. Baleni langkah wisuh.
6. Tambah 100μL HRP-streptavidin solusi kerja ing saben sumur.Tutup nganggo piring sealer.Inkubasi 30 menit ing suhu kamar kanthi goyang ing 500rpm.
7. Baleni maneh langkah ngumbah.
8. Tambah 100μL larutan substrat TMB ing saben sumur.Tutup nganggo piring sealer.Inkubasi 30 menit ing RT Protect saka cahya.Cairan bakal dadi biru kanthi tambahan solusi substrat.
9. Tambah 50μL solusi stop menyang saben sumur.Cairan bakal dadi kuning kanthi tambahan solusi stop.Banjur mbukak maca microplate lan nindakake pangukuran ing 450nm langsung.
Pitungan asil
1. Rata-rata wacan duplikat kanggo saben standar, kontrol, lan conto lan nyuda Kapadhetan optik standar nol rata-rata.Nggawe kurva standar kanthi absorbansi ing sumbu vertikal (Y) lan konsentrasi dsRNA ing sumbu horisontal (X).
2. Disaranake kanggo nindakake pitungan karo piranti lunak kurva-fitting basis komputer kayata pakar kurva 1.3 utawa ELISA Calc ing 5 utawa 4 parameter model non-linear pas.
Kinerja
1. Sensitivitas:
wates ngisor deteksi: ≤ 0,001pg/μL (kanggo UTP-, pUTP-, N1-Me-pUTP-dsRNA), ≤ 0,01pg/μL (kanggo 5-OMe-UTP-dsRNA).
watesan ngisor saka jumlah: 0,0156 pg / μL (kanggo UTP-, pUTP-dsRNA), 0,0312 pg / μL (kanggo N1-Me-pUTP-dsRNA), 0,0625 pg / μL (kanggo 5-OMe-UTP-dsRNA).
2. Presisi: CV saka Intra-Assay ≤10%, CV saka Inter-Assay ≤10%
3. Recovery: 80% ~ 120%
4. Linearitas: 0.0156-0.5pg/μL(kanggoUTP-,pUTP-dsRNA)0.0312-1pg/μL(kanggo N1-Me-pUTP dsRNA),0.0625-1pg/μL(kanggo 5-OMe-UTP-dsRNA).
Pertimbangan
1. Suhu reaksi TMB lan wektu kritis, please kontrol wong miturut instruction strictly.
2. Supaya kanggo entuk reproducibility assay apik lan sensitivitas, ngumbah piring sing tepat kanggo mbusak keluwihan reagen un-reacted iku penting.
3. Kabeh reagen kudu dicampur sak tenane sadurunge digunakake lan supaya bumbles sak sampel utawa reagen tambahan.
4. Yen kristal wis kawangun ing buffer wisuh klempakan (20x), anget kanggo 37 ℃ lan nyampur alon-alon nganti kristal rampung dipun bibaraken.
5. Ngindhari uji sampel sing ngemot Sodium Azide (NaN3), amarga bisa ngrusak aktivitas HRP sing nyebabake kurang ngira jumlah dsRNA.
6. Supaya kontaminasi RNase sak assay.
7. Standar / sampel, antibodi deteksi lan SA-HRP uga bisa ditindakake ing RT tanpa goyang, nanging bisa nyebabake nyuda sensitivitas deteksi kaping pindho.Kanggo kasus iki, disaranake standar UTP lan pUTP dsRNA kudu diencerke saka 2pg / μL, standar N1-Me-pUTP dsRNA kudu diencerke saka 4pg / μL lan standar 5-OMe-UTP dsRNA kudu diencerke saka 8pg / μL.Kajaba iku, inkubasi solusi kerja HRP-streptavidin sajrone 60 menit ing suhu kamar.Aja nggunakake flask shaker, amarga flask shaker bisa nyebabake asil sing ora akurat.
Hasil khas
1. Data kurva standar
| konsentrasi (pg/ml) | N1-Me-pUTP modifikasi standar dsRNA | ||
| OD450-OD650(1) | OD450-OD650(2) | RATA-RATA | |
| 2 | 2.8412 | 2.7362 | 2.7887 |
| 1 | 1.8725 | 1.9135 | 1.8930 |
| 0.5 | 1.0863 | 1.1207 | 1.1035 |
| 0.25 | 0.623 | 0.6055 | 0.6143 |
| 0.125 | 0.3388 | 0.3292 | 0.3340 |
| 0,0625 | 0.1947 | 0.1885 | 0.1916 |
| 0.0312 | 0. 1192 | 0.1247 | 0.1220 |
| 0 | 0,0567 | 0,0518 | 0,0543 |
2. Pitungan kurva standar
3. Range deteksi Liner: 0,0312- 1pg / μL
| Konsentrasi (pg/μl) | OD450-OD650 |
| 1 | 1.8930 |
| 0.5 | 1.1035 |
| 0.25 | 0.6143 |
| 0.125 | 0.3340 |
| 0,0625 | 0.1916 |
| 0.0312 | 0.1220 |
