PNGase F
Peptida-N-Glycosidase F(PNGase F) minangka cara enzimatik sing paling efektif kanggo ngilangi meh kabeh oligosakarida sing ana gandhengane karo N saka glikoprotein.PNGase F minangka amidase, sing misahake ing antarane residu GlcNAc lan asparagine saka oligosakarida mannose, hibrida, lan kompleks sing dhuwur saka glikoprotein sing ana gandhengane karo N.
Aplikasi
Enzim iki migunani kanggo ngilangi residu karbohidrat saka protein.
Preparation lan specification
| Penampilan | Cairan Tanpa Warna |
| Kemurnian protein | ≥95% (saka SDS-PAGE) |
| Kegiatan | ≥500.000 U/mL |
| Eksoglikosidase | Ora ana aktivitas sing bisa dideteksi (ND) |
| Endoglycosidase F1 | ND |
| Endoglycosidase F2 | ND |
| Endoglycosidase F3 | ND |
| Endoglycosidase H | ND |
| Protease | ND |
Properti
| nomer EC | 3.5.1.52(Rekombinan saka mikroorganisme) |
| Bobot molekul | 35 kDa (SDS-PAGE) |
| Titik isoelektrik | 8. 14 |
| pH optimal | 7.0-8.0 |
| Suhu paling optimal | 65 °C |
| Kekhususan substrat | Pecah ikatan glikosidik antarane GlcNAc lan residu asparagine Fig.1 |
| Situs pangenalan | Glikan sing disambung-N kajaba ngemot fukosa α1-3 Gambar 2 |
| Aktivator | DTT |
| Inhibitor | SDS |
| Suhu panyimpenan | -25 ~-15 ℃ |
| Inactivation panas | Campuran reaksi 20µL sing ngemot 1µL PNGase F ora aktif kanthi inkubasi ing suhu 75 °C suwene 10 menit. |
Gambar 1. Spesifisitas substrat PNGase F
Fig. 2 Pangenalan lenggah PNGase F.
Nalika residu GlcNAc internal disambungake menyang fucose α1-3, PNGase F ora bisa mecah oligosakarida sing disambung N saka glikoprotein.Modifikasi iki umum ing tetanduran lan sawetara glikoprotein serangga.
Componèn
|
| Komponen | Konsentrasi |
| 1 | PNGase F | 50 µl |
| 2 | 10×Glikoprotein Denaturing Buffer | 1000 µl |
| 3 | 10×GlycoBuffer 2 | 1000 µl |
| 4 | 10% NP-40 | 1000 µl |
Definisi unit
Siji unit(U) ditetepake minangka jumlah enzim sing dibutuhake kanggo mbusak > 95% karbohidrat saka 10 µg RNase B sing didenaturasi sajrone 1 jam ing 37°C kanthi volume reaksi total 10 µL.
Kondisi reaksi
1. Larutake 1-20 µg glikoprotein nganggo banyu deionisasi, tambahake 1 µl 10×Glycoprotein Denaturing Buffer lan H2O (yen perlu) kanggo nggawe volume reaksi total 10 µl.
2.Inkubasi ing 100 ° C suwene 10 menit, adhem ing es.
3.Tambah 2 µl 10×GlycoBuffer 2, 2 µl 10% NP-40 lan nyampur.
4.Tambah 1-2 µl PNGase F lan H2O (yen perlu) kanggo nggawe volume reaksi total 20 µl lan nyampur.
5.Reaksi inkubasi ing 37 ° C suwene 60 menit.
6.Kanggo analisis SDS-PAGE utawa analisis HPLC.
