Enzim Capping Virus Vaccinia
Enzim capping virus Vaccinia asalé saka galur E. coli rekombinan mawa gen kanggo enzim capping Vaccinia.Enzim tunggal iki dumadi saka rong subunit (D1 lan D12) lan nduweni telung aktivitas enzimatik (RNA triphosphatase lan guanylyltransferase dening subunit D1 lan guanin methyltransferase dening subunit D12).Vaccinia virus Capping Enzyme efektif kanggo catalyze tatanan struktur tutup, kang bisa khusus masang struktur tutup 7-methylguanylate (m7Gppp, Cap 0) kanggo mburi 5′ RNA.Struktur tutup (Cap 0) nduweni peran penting ing stabilisasi, transportasi lan translasi mRNA ing eukariota.Capping RNA kanthi reaksi enzimatik minangka cara sing efektif lan prasaja sing bisa ningkatake stabilitas lan terjemahan RNA kanggo transkripsi in vitro, transfeksi, lan mikroinjeksi.
Komponen
Enzim Capping Virus Vaccinia (10 U/μL)
10 × Capping Buffer
Kondisi panyimpenan
-25～- 15℃ kanggo panyimpenan （ Ngindhari siklus beku-thaw bola-bali）
Buffer panyimpenan
20 mM Tris-HCl (pH 8,0), 100 mM NaCl,
1mM DTT, 0. 1mM EDTA, 0. 1% Triton X- 100, 50% gliserol.
Definisi Unit
Siji unit Enzim Capping virus Vaccinia ditetepake minangka jumlah enzim sing dibutuhake kanggo nggabungake 10pmol GTP menyang transkrip 80nt sajrone 1 jam ing suhu 37°C.
Kontrol kualitas
Eksonuklease:10U virus Vaccinia Capping Enzyme kanthi 1μg λ-Hind III nyerna DNA ing 37 ℃ suwene 16 jam ora ngasilake degradasi kaya sing ditemtokake dening elektroforesis gel agarose.
Endonuklease:10U saka Vaccinia virus Capping Enzyme karo 1μg λDNA ing 37 ℃ suwene 16 jam ora ngasilake degradasi kaya sing ditemtokake dening elektroforesis gel agarose.
Nickase:10U saka Vaccinia virus Capping Enzyme kanthi 1 μg pBR322 ing 37 ℃ suwene 16 jam ora ngasilake degradasi kaya sing ditemtokake dening elektroforesis gel agarose.
RNase:10U saka Vaccinia virus Capping Enzyme karo 1.6μg MS2 RNA suwene 4 jam ing 37 ℃ ora ngasilake degradasi kaya sing ditemtokake dening elektroforesis gel agarose.
1.coli DNA:10U saka Vaccinia virus Capping Enzyme disaring kanggo anané DNA genom E. coli nggunakake TaqMan qPCR kanthi primer khusus kanggo lokus E. coli 16S rRNA.Kontaminasi DNA genom E. coli yaiku≤1 genom E. coli.
2.Bakteri Endotoksin: LAL-test, miturut Chinese Pharmacopoeia IV edisi 2020, metode tes watesan gel, aturan umum (1143).Isi endotoksin bakteri kudu ≤10 EU/mg.
Sistem lan kahanan reaksi
1. Capping Protocol (volume reaksi: 20 μL)
Prosedur iki ditrapake kanggo reaksi capping 10μg RNA (≥100 nt) lan bisa ditingkatake miturut panjaluk eksperimen.
I) Gabungke 10μg RNA lan H2O bebas Nuklease ing tabung mikrofuge 1,5 ml nganti volume pungkasan 15,0 μL.*10×Capping Buffer: 0,5M Tris-HCl, 50 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, (25 ℃, pH 8,0)
2) Kalor ing 65 ℃ kanggo 5 menit banjur es bath kanggo 5 menit.
3) Tambah komponen ing ngisor iki ing urutan kasebut
| Componèn | Volume |
| RNA Denatured (≤10μg, dawa≥100 nt) | 15 μL |
| 10 × Capping Buffer * | 2 μl |
| GTP (10 mM) | 1 μL |
| SAM (2 mM) | 1 μL |
| Enzim Capping Virus Vaccinia (10U/μL) | 1 μL |
*10×Penyangga Capping:0,5 M Tris-HCl, 50 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, (25 ℃, pH8,0)
4) Inkubasi ing 37 ° C suwene 30 menit, RNA saiki ditutup lan siap kanggo aplikasi hilir.
2. 5 'terminal reaksi labeling (volume reaksi: 20 μL)
Protokol iki dirancang kanggo menehi label RNA sing ngemot 5' trifosfat lan bisa ditingkatake miturut panjaluk.Efisiensi penggabungan label bakal kena pengaruh rasio molar RNA: GTP, uga konten GTP ing conto RNA.
1) Gabungke jumlah RNA lan H2O bebas Nuklease sing cocog ing tabung mikrofuge 1,5 ml nganti volume pungkasan 14,0 µL.
2) Kalor ing 65 ℃ kanggo 5 menit banjur es bath kanggo 5 menit.
3) Tambah komponen ing ngisor iki ing urutan kasebut.
| Componèn | Volume |
| RNA denaturasi | 14 μl |
| 10 × Capping Buffer | 2 μl |
| Campuran GTP** | 2 μl |
| SAM (2 mM) | 1 μL |
| Enzim Capping Virus Vaccinia (10U/μL) | 1 μL |
** GTP MIX nuduhake GTP lan nomer cilik saka panandha.Kanggo konsentrasi GTP, wacakanggo Wigati 3.
4) Inkubasi ing 37 ° C suwene 30 menit, ujung RNA 5′ saiki diwenehi label lan siap kanggo hilir
Aplikasi
1. Capping mRNA sadurunge tes terjemahan / terjemahan in vitro
2. Labeling 5' pungkasan mRNA
Cathetan babagan panggunaan
1.Pemanasan solusi RNA sadurunge inkubasi karo Vaccinia Capping Enzyme mbusak struktur sekunder ing 5' pungkasan transkrip.Tambah wektu nganti 60 menit kanggo transkrip kanthi 5'ends sing terstruktur banget.
2. RNA sing digunakake kanggo reaksi capping kudu diresiki sadurunge digunakake lan dilereni soko tugas ing banyu tanpa nuklease.EDTA ngirim ora ana lan solusi kudu bebas saka uyah.
3. Kanggo menehi label ing mburi 5', total konsentrasi GTP kudu watara 1-3 kaping konsentrasi molar mRNA ing reaksi.
4. Volume saka sistem reaksi bisa scaled munggah utawa mudhun miturut nyata.
