M-MLV Neoscript Reverse Transcriptase
Neoscript Reverse Transcriptase minangka reverse transcriptase sing dipikolehi kanthi screening mutasi gen M-MLV saka Moloney murine leukemia virus asal lan ekspresi ing E.coli.Enzim mbusak aktivitas RNase H, nduweni toleransi suhu sing luwih dhuwur, lan cocok kanggo transkripsi mbalikke suhu dhuwur.Mulane, mbiyantu ngilangi efek sing ora becik saka struktur tingkat dhuwur RNA lan faktor non-spesifik ing sintesis cDNA, lan nduweni stabilitas sing luwih dhuwur lan kemampuan sintesis transkripsi mbalikke.Enzim kasebut nduweni stabilitas sing luwih dhuwur lan kemampuan sintesis transkripsi mbalikke.
Komponen
1.200 U/μL Neoscript Reverse Transcriptase
2.5 × First-Strand Buffer (opsional)
* 5 × First-Strand Buffer ora ngemot dNTP, tambahake dNTP nalika nyiapake sistem reaksi
Aplikasi sing Disaranake
1.Siji-langkah qRT-PCR.
2.Deteksi virus RNA.
Kondisi panyimpenan
-20 ° C kanggo panyimpenan jangka panjang, kudu dicampur kanthi becik sadurunge digunakake, supaya ora beku-thaw.
Definisi Unit
Siji unit ngemot 1 nmol dTTP sajrone 10 menit ing suhu 37°C nggunakake poli(A)•oligo(dT)25minangka cithakan / primer.
Kontrol kualitas
1.SDS-PAGE kemurnian elektroforesis luwih saka 98%.
2.Sensitivitas amplifikasi, kontrol batch-to-batch, stabilitas.
3.Ora ana aktivitas nuklease eksogen, ora ana kontaminasi endonuklease eksogen utawa eksonuklease
Persiyapan Reaksi kanggo Solusi Reaksi Rantai Kapisan
1.Preparation saka campuran reaksi
| Komponen | Volume |
| Oligo (dT)12-18 Primer utawa Random Primera Utawa Primer Spesifik Geneb | 50 pml |
| 50 pmol (20-100 pmol) | |
| 2 pml | |
| 10 mM dNTP | 1 μL |
| Cithakan RNA | Total RNA≤ 5μg;mRNA≤ 1 μg |
| dH bebas RNase2O | Iki 10 μL |
Cathetan:a/b: Pilih macem-macem jinis primer miturut kabutuhan eksperimen sampeyan.
2.Kalorake ing 65 ° C suwene 5 menit lan adhem kanthi cepet ing es sajrone 2 menit.
3.Tambah komponen ing ngisor iki menyang sistem ing ndhuwur nganti volume total 20µL lan nyampur alon-alon:
| Komponen | Volume (μL) |
| 5 × First-Strand Buffer | 4 |
| Neoscript Reverse Transcriptase (200 U/μL) | 1 |
| Inhibitor RNase (40 U/μL) | 1 |
| dH bebas RNase2O | Iki 20 μL |
4. Mangga nindakake reaksi miturut kondisi ing ngisor iki:
(1) Yen Random Primer digunakake, reaksi kudu digawa metu ing 25 ℃ kanggo 10mins, lan banjur ing 50 ℃ kanggo 30 ~ 60mins;
(2) Yen Oligo dT utawa primer tartamtu digunakake, reaksi kudu digawa metu ing 50 ℃ kanggo 30 ~ 60mins.
5.Kalor ing 95 ℃ suwene 5 menit kanggo mateni Neoscript Reverse Transcriptase lan mungkasi reaksi kasebut.
6.Produk transkripsi mbalikke bisa digunakake langsung ing reaksi PCR lan reaksi PCR kuantitatif fluoresensi, utawa disimpen ing -20 ℃ kanggo dangu.
PCR Raksi:
1.Preparation saka campuran reaksi
| Komponen | Konsentrasi |
| 10 × PCR Buffer (bebas dNTP, bebas Mg²+) | 1× |
| dNTPs (10mM saben dNTP) | 200 μM |
| 25 mM MgCl2 | 1-4 mM |
| Taq DNA Polymerase (5U/μL) | 2-2.5 U |
| Primer 1 (10 μM) | 0,2-1 μM |
| Primer 2 (10 μM) | 0,2-1 μM |
| Cithakana | ≤10% Solusi Reaksi Rantai Kapisan (2 μL) |
| ddH2O | Iki 50 μL |
Cathetan:a: Yen kakehan solusi reaksi berantai pisanan ditambahake, reaksi PCR bisa nyandhet.
2.Prosedur Reaksi PCR
| Langkah | Suhu | Wektu | Siklus |
| Pra-denaturasi | 95 ℃ | 2-5 min | 1 |
| Denaturasi | 95 ℃ | 10-20 detik | 30-40 |
| Annealing | 50-60 ℃ | 10-30 detik | |
| Ekstensi | 72 ℃ | 10-60 detik |
Cathetan
1.Cocog kanggo optimasi suhu transkripsi mbalikke ing kisaran 42 ℃ ~ 55 ℃.
2.Nduwe stabilitas sing luwih apik, cocog kanggo amplifikasi transkripsi mbalikke suhu dhuwur.Kajaba iku, luwih becik kanggo ngliwati wilayah struktural kompleks RNA kanthi efisien.Uga, ikucocok kanggo siji-langkah multiplex fluoresensi kuantitatif RT-PCR deteksi.
3.Kompatibilitas apik karo macem-macem enzim amplifikasi PCR lan cocok kanggo reaksi RT-PCR sensitivitas dhuwur.
4.Cocog kanggo sensitivitas dhuwur siji-langkah fluoresensi kuantitatif RT-PCR reaksi, èfèktif nambah tingkat deteksi kurang konsentrasi Cithakan.
5.Cocog kanggo konstruksi perpustakaan cDNA.
