M-MLV Reverse Transcriptase
RevScript Reverse transcriptase diduweni dening teknologi rekayasa genetika.Nduwe kemampuan sintesis cDNA sing luwih dhuwur, stabilitas termal lan watesan suhu reaksi (nganti 60°C).Produk cDNA sing disintesis nganti 10 kb.Iku nambah karemenan saka cithakan lan cocok kanggo mbalikke transkripsi cithakan RNA karo struktur secondary Komplek utawa gen salinan kurang.
Komponen
| Komponen | HC2003B (10.000U) | HC2003B (5*10.000U) | HC2003B (200.000U) |
| RevScript Reverse Transcriptase (200U/μL) | 50 μL | 5 × 50 μl | 1 ml |
| 5 × RevScript Buffer | 250 μL | 1,25 ml | 5 ml |
Kondisi panyimpenan
Produk iki kudu disimpen ing -25 ° C ~ -15 ° C suwene 2 taun.
Definisi Unit
Siji unit nggabungake 1 nmol dTTP dadi bahan sing ora larut asam sajrone 10 menit ing suhu 37 ° C nggunakake Oligo (dT) minangka primer.
Setelan Reaksi
1.Denaturasi cithakan RNA (Langkah iki opsional, denaturasi cithakan RNA mbantu mbukak struktur sekunder, sing bakal ningkatake asil cDNA untaian pertama.)
| Komponen | Volume (μL) |
| ddH bebas RNase2O | Kanggo 13 |
| Oligo (dT)18 (50 μmol/L) utawa Primer Acak (50 μmol/L) Utawa Primer Spesifik Gen (2 μmol/L) | 1 |
| utawa 1 | |
| utawa 1 | |
| Cithakan RNA | X a |
Cathetan:
1) a: Total RNA: 1-5 ug utawa mRNA: 1-500 ng
2) Inkubasi ing 65 ° C suwene 5 menit, banjur transfer ing es langsung kanggo adhem nganti 2 menit.Sentrifugasi singkat kanggo ngumpulake cairan reaksi, tambahake solusi reaksi transkripsi mbalikke kaya sing ditampilake ing tabel ing ngisor iki.Pipet alon-alon kanggo nyampur.
1.Preparation saka campuran reaksi (volume 20 μL)
| Komponen | Volume (μL) |
| Campuran langkah sadurunge | 13 |
| 5 × Buffer | 4 |
| Campuran dNTP (10nmol/L) | 1 |
| Reverse Transcriptase (200 U/μL) | 1 |
| Inhibitor RNase (40 U/μL) | 1 |
1.Nindakake reaksi ing kahanan ing ngisor iki:
| Suhu (°C) | Wektu |
| 25 °Ca | 5 menit |
| 42 °Cb | 15-30min |
| 85 °Cc | 5 menit |
Cathetan:
1) a.Inkubasi ing 25 ° C kanggo 5 menit dibutuhake mung kanggo nggunakake hexamers acak.Lewati langkah iki nalika nggunakake Oligo (dT)18utawa Primer Spesifik Gene.
2) b.Suhu transkripsi mbalikke sing disaranake yaiku 42 ° C, Kanggo cithakan kanthi struktur sekunder sing rumit utawa konten GC sing dhuwur, dianjurake kanggo ngunggahake suhu reaksi nganti 50-55 ° C.
3) c.Pemanasan ing 85 ° C suwene 5 menit kanggo mateni reverse transcriptase.
4) Produk bisa langsung digunakake ing reaksi PCR utawa qPCR, utawa disimpen ing -20 ° C kanggo panyimpenan jangka pendek.Dianjurake kanggo aliguot produk lan nyimpen ing -80 ° C kanggo panyimpenan long-term.Aja kerep beku-thaw.
5) Prodhuk cocok kanggo siji-langkah RT-qPCR, dianjurake kanggo nambah 10-20 U reverse transcriptase kanggo saben sistem reaksi 25μL, utawa mboko sithik nambah jumlah mbalikke transcriptase miturut kahanan nyata.
Cathetan
1.Mangga supaya area eksperimen tetep resik;Sarung tangan lan topeng sing resik kudu dianggo sajrone operasi.Kabeh bahan sing digunakake ing eksperimen kudu bebas RNase kanggo nyegah kontaminasi RNase.
2.Kabeh prosedur kudu ditindakake ing es kanggo nyegah degradasi RNA.
3.Sampel RNA kualitas dhuwur dianjurake kanggo njamin efisiensi dhuwur saka transkripsi mbalikke.
4.Produk iki mung kanggo riset.
5.Mangga operate nganggo jas lab lan sarung tangan sekali pakai, kanggo safety sampeyan.
