RTL Reverse Transcriptase
RTL reverse transcriptase minangka polimerase DNA sing gumantung karo cithakan RNA sing ora nduweni aktivitas exonuclease 3'→5' lan nduweni aktivitas RNase H.Enzim iki bisa nggunakake RNA minangka cithakan kanggo sintesis untaian komplementer DNA, kang bisa Applied kanggo sintesis cDNA untai pisanan, utamané kanggo RT-LAMP (loop-mediated isothermal amplifikasi).Dibandhingake karo RTL reverse transcriptase 1.0, sensitivitas saya tambah akeh, stabilitas termal luwih kuat, lan reaksi ing 65 ° C luwih stabil.RTL reverse transcriptase (gliserol gratis) bisa digunakake kanggo nyiapake preparat lyophilized, reagen RT-LAMP lyophilized etc.
Definisi Unit
Siji unit nggabungake 1 nmol dTTP dadi bahan sing bisa diencerake asam sajrone 20 menit ing suhu 50 ° C nggunakake poly(A)•oligo(dT)25 minangka template-primer.
Komponen
| Komponen | HC5008A-01 | HC5008A-02 | HC5008A-03 |
| RTL Reverse Transcriptase (Bebas Gliserol) (15U/μL) | 0,1 ml | 1 ml | 10 ml |
| 10 × HC RTL Buffer | 1,5 ml | 4 × 1,5 ml | 5 × 10 ml |
| MgSO4 (100mM) | 1,5 ml | 2 × 1,5 ml | 3 × 10 ml |
Kondisi panyimpenan
Transportasi ing ngisor 0 ° C lan disimpen ing -25 ° C ~ -15 ° C.
Kontrol kualitas
- Sisa Kegiatan KabEndonuklease:Reaksi 50 μL sing ngemot 1 μg λDNA lan 15 unit RTL2.0 sing diinkubasi sajrone 16 jam ing suhu 37 ℃ nuduhake pola sing padha karo kontrol negatif kanthi elektroforesis gel.
- Sisa Kegiatan KabExonuclease:Reaksi 50 μL sing ngemot 1 μg Hind Ⅲ λDNA sing dicerna lan 15 unit RTL2.0 sing diinkubasi sajrone 16 jam ing 37 ℃ nuduhake pola sing padha karo kontrol negatif kanthi elektroforesis gel.
- Sisa Kegiatan KabNickase:Reaksi 50 μL sing ngemot 1 μg pBR322 supercoiled lan 15 unit RTL2.0 sing diinkubasi sajrone 4 jam ing 37 ° C nuduhake pola sing padha karo kontrol negatif kanthi elektroforesis gel.
- Sisa Kegiatan KabRNase:Reaksi 10 μL sing ngemot 0,48 μg MS2 RNA lan 15 unit RTL2.0 sing diinkubasi sajrone 4 jam ing suhu 37 ° C nuduhake pola sing padha karo kontrol negatif kanthi elektroforesis gel.
- E. coli gDNA:Diukur karoE. colikit deteksi HCD spesifik, 15 unit RTL2.0 ngemot kurang saka 1E. coligénom.
Setelan Reaksi
Protokol Sintesis cDNA
| Komponen | Volume |
| Cithakan RNA a | opsional |
| Oligo(dT) 18~25(50uM) utawa Random Primer mix(60uM) | 2 μl |
| Campuran dNTP (masing-masing 10mM) | 1 μL |
| Inhibitor RNase (40U/uL) | 0,5 μL |
| RTL Reverse Transcriptase 2.0 (15U/uL) | 0,5 μL |
| 10 × HC RTL Buffer | 2 μl |
| Banyu Nuklease | Iki 20 μL |
Cathetan:
1) Dosis sing disaranake saka Total RNA yaiku 1ng ~ 1μg
2) Dosis mRNA sing disaranake yaiku 50ng ~ 100ng
Thermo-cycling Kahanan kanggo tumindake reaksi:
| Suhu (°C) | Wektu |
| 25 °Ca | 5 menit |
| 55 °C | 10 menitb |
| 80 °C | 10 menit |
Cathetan:
1) Yen Random Primer Mix digunakake, langkah inkubasi ing 25 ° C.
2) Yen target campuran primer digunakake, langkah inkubasi ing 55 ° C kanggo 10 ~ 30mins.
RT-LAMP Protokol
| Komponen | Volume | Konsentrasi pungkasan |
| Cithakan RNA | opsional | ≥10 eksemplar |
| Campuran dNTP (10mM) | 3,5 l | 1,4 mM |
| FIP/BIP Primer (25×) | 1 μL | 1,6 μM |
| Primer F3/B3 (25×) | 1 μL | 0,2 μM |
| Primer LoopF/LoopB (25×) | 1 μL | 0,4 μM |
| Inhibitor RNase (40U/μL) | 0,5 μL | 20 U/Reaksi |
| RTL Reverse Transcriptase 2.0 (15U/μL) | 0,5 μL | 7.5 U / Reaksi |
| Bst V2 DNA Polimerase (8U/μL) | 1 μL | 8 U/Reaksi |
| MgSO4 (100mM) | 1,5 μl | 6 mM (Total 8 mM) |
| 10×HC RTL Buffer (utawa 10×HC Bst V2 Buffer) | 2,5 l | 1 × (2mM Mg2+) |
| Banyu Nuklease | Iki 25 μL | - |
Cathetan:
1) Nyampur kanthi vortexing lan centrifuge sedhela kanggo ngumpulake.Inkubasi suhu konstan ing 65 ° C suwene 1 jam.
2) Loro buffer bisa dioperasikake lan duwe komposisi sing padha.
Cathetan
1.Produk iki bakal mbentuk padhet putih nalika disimpen ing -20 °C.Njupuk metu saka -20 ° C lan sijine ing es kanggo bab 10 menit.Sawise leleh, bisa digunakake kanthi goyang lan nyampur.
2.Produk cDNA bisa disimpen ing -20°C utawa -80°C utawa langsung digunakake kanggo reaksi PCR.
3. Kanggo nyegah kontaminasi RNase, tulung supaya area eksperimen tetep resik, lan nganggo sarung tangan lan topeng sing resik sajrone operasi.
