Uracil DNA Glikosilase
Uracil-DNA Glycosylase (UNG utawa UDG) minangka klon rekombinan E.coli kanthi bobot molekul 25 kDa.Iku catalyzes release saka uracil free saka uracil-ngemot siji-stranded lan pindho-stranded DNA, lan ora aktif marang RNA, lan bisa digunakake kanggo nyegah kontaminasi produk amplifikasi PCR.Prinsip tumindak adhedhasar kasunyatan manawa dUTP diganti karo dTTP ing reaksi PCR lan produk amplifikasi PCR sing ngemot basa dU dibentuk, enzim kasebut bisa kanthi selektif ngilangi ikatan glikosidik basa U kanthi untaian tunggal lan untaian ganda. DNA lan degradasi produk amplifikasi PCR.
Aplikasi sing Disaranake
Amplifikasi Nyegah Kontaminasi
Kondisi panyimpenan
-20 ° C kanggo panyimpenan jangka panjang, kudu dicampur kanthi becik sadurunge digunakake, supaya ora beku-thaw.
Buffer panyimpenan
20 mM Tris-HCl (pH 8,0), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, Stabilizer, 50% Gliserol.
Definisi Unit
Jumlah enzim sing dibutuhake kanggo ngurai 1µg DNA untai tunggal sing ngemot basa dU sajrone 1 jam ing suhu 37°C yaiku 1 unit.
Kontrol kualitas
1.SDS-PAGE kemurnian elektroforesis luwih saka 98%
2.Sensitivitas amplifikasi, kontrol batch-to-batch, stabilitas
3.Sawise 1U saka UNG diolah ing 50 ℃ sajrone 2 menit, cithakan sing ngemot U ing ngisor 103 salinan kudu dirusak lan ora ana produk amplifikasi sing bisa diprodhuksi.
4.Ora ana aktivitas nuklease eksogen
instruksi
| Komponen | Volume (μL) | Konsentrasi pungkasan |
| 10 × PCR Buffer (bebas dNTP, Mg²+gratis) | 5 | 1× |
| dUTP (dCTP, dGTP, dATP) | - | 200 μM |
| dUTP (ganti dTTP) | - | 200-600 μM |
| 25 mM MgCl2 | 2-8 μl | 1-4 mM |
| 5 U/μL Taq | 0.25 | 1.25 U |
| 5 U/μL UNG | 0.25 (0.1-0.5) | 0,25 U (0,1-0,5) |
| 25 × Primer Mixa | 2 | 1× |
| Cithakan | - | <1μg/reaksi |
| ddH₂O | Kanggo 50 | - |
Cathetan: a: Yen digunakake kanggo qPCR / qRT-PCR, probe neon kudu ditambahake menyang sistem reaksi.Biasane, konsentrasi primer pungkasan 0,2 μM bisa menehi asil sing apik;nalika kinerja reaksi kurang, konsentrasi primer bisa diatur ing kisaran 0.2-1 μM.Biasane, konsentrasi probe dioptimalake ing kisaran 0,1-0,3 μM.Eksperimen gradien konsentrasi bisa ditindakake kanggo nemokake kombinasi primer lan probe sing paling apik.
Cathetan
1.Enzim UNG bisa digunakake kanggo mbusak produk amplifikasi dUTP sing kontaminasi saka sistem reaksi sadurunge reaksi amplifikasi PCR, banjur supaya asil positif palsu amarga kontaminasi produk.
2.Suhu optimal kanggo enzim UNG kanggo digunakake ing reaksi PCR anti-kontaminasi umume 50 ℃ kanggo 2mins;kondisi inaktivasi punika 95 ℃ kanggo 5mins.
3.Aja kerep beku-thaw, lan aja nyedhiyakake fluktuasi suhu sing gedhe.
4.Gen sing beda kanggo digedhekake duwe efisiensi panggunaan dUTP lan sensitivitas enzim UNG sing beda, mula, yen nggunakake sistem UNG nyebabake nyuda sensitivitas deteksi, sistem reaksi kudu diatur lan dioptimalake, yen sampeyan butuh dhukungan teknis, hubungi perusahaan kita.
