EndoFree Plasmid Maxi Kit

Kondisi panyimpenan

RNaseA kudu disimpen ing -30 ~ -15 ℃ lan diangkut ing ≤0 ℃.

Endotoxin Scavenger bisa disimpen ing 2 ~ 8 ℃ kanggo siji sasi, disimpen ing -30 ~ -15 ℃ kanggo panyimpenan long-termlan diangkut ing ≤0 ℃.

Komponen liyane kudu disimpen ing suhu kamar (15 ~ 25 ℃) lan diangkut ing suhu kamar.

Komponen

RNaseA:10 mg / ml, digunakake kanggo mbusak RNA.

Penyangga P1:buffer penundaan bakteri, nambah RNaseA kanggo Buffer P1 sadurunge nggunakake pisanan.

Buffer P2:buffer lisis bakteri (ngandhut SDS / NaOH).

Buffer P4:buffer netralisasi.

Pemulung endotoksin:kanthi efektif mbusak endotoksin saka ekstrak plasmid mentah.

Buffer PW:buffer wisuh, nambah volume stipulated saka etanol sadurunge nggunakake pisanan.

Buffer TB:buffer elusi.

Kolom Maxi DNA FastPure:kolom adsorpsi DNA plasmid.

Tabung Koleksi 50 ml:tabung koleksi filtrat.

Tabung Koleksi Bebas Endotoksin:tabung koleksi DNA plasmid.

Bahan sing disiapake

Etanol absolut, isopropanol, 50 ml tabung centrifuge bunder ngisor lan 50 ml bebas endotoksintabung centrifuge.

Aplikasi

Produk iki cocok kanggo ekstraksi plasmid skala gedhe saka 150 - 300 ml larutan bakteri.kabudayan sewengi.

Proses Eksperimen

1. Njupuk 150 - 200 ml (ora luwih saka 300 ml) saka solusi bakteri kultur sewengi lan centrifuge ingudakara 11.000 rpm (12.000 × g) suwene 1 – 2 menit.Buang supernatant lan kumpulake bakteri.

Δ Nalika ngumpulake luwih saka 50 ml larutan bakteri, bakteri bisa dikumpulake kanthi nambahake larutan bakteri, sentrifugasi, mbuwang supernatan lan langkah liyane ing tabung 50 ml sing padha kanggo

kaping pirang-pirang.

2. Tambah 7,5 ml Buffer P1 (mangga priksa manawa RNaseA wis ditambahake menyang Buffer P1) menyang centrifugetabung ngemot bakteri lan nyampur sak tenane dening vortex utawa pipetting.

Δ Resuspensi lengkap bakteri ing langkah iki penting kanggo ngasilake, lan ora ana gumpalan bakteri sawise resuspensi.Yen ana gumpalan bakteri sing ora dicampur kanthi lengkap, bakal nyebabake lisis, nyebabake asil lan kemurnian sing kurang.Yen OD600 saka solusi bakteri yaiku 0,65, dianjurake supaya 7,5 ml Buffer P1 digunakake nalika ngekstrak saka 150 ml larutan bakteri;nalika OD600 punika 0,75, 8 ml Buffer P1 kudu digunakake lan volume Buffers P2 lan P4 kudu diganti patut.Yen volume larutan bakteri tambah nganti 200 ml, disaranakevolume Buffer P1, P2, lan P4 ditambahake kanthi proporsional.

3. Tambah 7,5 ml Buffer P2 menyang suspensi bakteri saka langkah 2 lan nyampur alon-alon munggah lan mudhun kanggo 6 - 8kaping lan inkubasi ing suhu kamar kanggo 4-5 menit.

Δ Walik alon-alon kanggo nyampur sak tenane.Vortexing bakal nyebabake fragmentasi DNA genom, nyebabake fragmen DNA genom ing plasmid sing diekstrak.Ing wektu iki, solusi dadi kenthel lan translucent, nuduhake yen bakteri wis lysed lengkap.Durasi ora luwih saka 5 menit supaya ora ngrusak plasmid.Yen solusi ora cetha, bisa uga akeh bakteri sing nyebabakelisis ora lengkap, saengga jumlah bakteri kudu dikurangi kanthi tepat.

4. Tambah 7,5 ml Buffer P4 menyang suspensi bakteri saka langkah 3 lan langsung kuwalik alon-alon 6 - 8 kaping kanggo ngidini solusi rampung netralake Buffer P2.Ing wektu iki, precipitate flocculent putih kudu katon.Centrifuge ing luwih saka 11.000 rpm (12.000 × g) kanggo 10 - 15 menit, kanthi ati-ati pipet supernatant menyang tabung centrifuge 50 ml bunder-ngisor anyar (disiapake dhewe), lan supayaaspirate endapan putih sing ngambang.

Δ Tambah Buffer P4 lan langsung walik kanggo nyampur uga.Ninggalake tabung kanggo ngadeg nganti endapan putih disebarake kanthi merata ing saindhenging solusi kanggo nyegah produksi udan lokal sing bisa nyebabake netralisasi.Yen ora ana precipitate flocculent putih seragam sadurunge centrifugation lan supernatant ora cetha sawise centrifugation, tabung bisacentrifuge kanggo liyane 5 menit.

5. Tambah 0. 1 kaping volume (10% saka volume supernatant, bab 2.2 ml) saka Endotoksin Scavenger kanggo supernatant saka langkah 4 lan bali menyang campuran.Selehake solusi ing adus es utawa lebokake menyang es sing ditumbuk (utawa beku kulkas) suwene 5 menit nganti solusi kasebut owah saka keruh dadi bening lan transparan (utawa isihrada keruh), lan sok-sok nyampur kaping pirang-pirang.

Δ Sawise Endotoksin Scavenger ditambahake menyang supernatant, supernatant bakal dadi keruh nangingsupernatant kudu dadi cetha (utawa rada keruh) sawise cooling ing adus es.

6. Sawise supernatant diselehake ing suhu kamar (> 25 ℃) kanggo 10 - 15 min, iku bakal dadi turbid minangkasuhu sawijining mundhak kanggo suhu kamar.Banjur supernatan kudu dibalik kanggo nyampur.

Δ Yen suhu kamar luwih murah utawa sampeyan pengin nyuda wektu ekstraksi, supernatan bisa diinkubasi ing adus banyu 37 ~ 42 ℃ suwene 5 - 10 menit lan langkah sabanjure bisa ditindakake sawise supernatan.dadi keruh.

7. Centrifuge supernatant ing babagan 11.000 rpm (12.000 × g) kanggo 10 menit ing suhu kamar (suhu kudu > 25 ℃) kanggo misahake phase.Fase banyu ndhuwur ngandhut DNA nalika lapisan fase berminyak biru ngisor ngandhut endotoksin lan impurities liyane.Transfer ingDNA-ngemot fase banyu menyang tabung anyar lanmbusak lapisan lengo.

Δ Suhu sajrone sentrifugasi kudu luwih saka 25 ℃ amarga pemisahan fase efektif orakedadeyan yen suhu kurang banget.

Δ Yen pamisahan phase ora efektif, suhu centrifugation bisa diatur kanggo 30 ℃ lanwektu centrifugation bisa tambah kanggo 15 min.

Δ Aja nyedhot lapisan berminyak biru amarga ngandhut endotoksin lan rereged liyane.

Mekanisme

Netralisasi Lisis Resuspensi

◇ Tambah 7,5 ml Buffer P1

◇ Tambah 7,5 ml Buffer P2

◇ Tambah 7,5 ml Buffer P4

Ngilangi endotoksin

◇Tambah 0. 1 kaping volume supernatant saka Endotoxin Scavenger

Naleni lan Ngumbah

◇ Tambah 0,5 kaping volume isopropanol

◇ Tambah 10 ml Buffer PW