Kit PCR langsung tanduran
Cat Nomer: HCR2020A
Kit PCR Langsung Tanduran cocok kanggo amplifikasi langsung godhong tanduran, wiji, lan liya-liyane, lan bisa digunakake kanggo screening conto tanduran sing ora ngemot polisakarida lan polifenol.Polimerase DNA amplifikasi langsung adhedhasar evolusi sing diarahake nduweni toleransi sing unggul marang inhibitor PCR ing tetanduran.Kangge, iku njogo kinerja amplifikasi dhuwur, kang cocok kanggo amplifikasi pecahan DNA ing 5 kb.Lysis buffer A unik ing kit bisa digunakake kanggo lyse jaringan tanduran seger utawa beku.Iku gampang kanggo operate lan lysate bisa digunakake minangka cithakan kanggo amplifikasi tanpa dimurnèkaké.Sistem kasebut ngemot agen protèktif sing ngidini conto mentah bisa digedhekake kanthi efektif sawise pembekuan lan pencairan bola-bali.2 × Plant Direct Master Mix mung perlu nambah primer lan template kanggo nindakake reaksi amplifikasi, saéngga nyuda operasi pipetting lan nambah throughput deteksi lan reproducibility asil.
Komponen
| Komponen | 50 RXNS | 200 RXNS |
| 2 × Tanduran Langsung Master Mix | 1,25 ml | 4×1,25 ml |
| Buffer Lisis Langsung Tumbuhan A | 5 ml | 20 ml |
| Buffer Lisis Langsung Pabrik B* | 5 ml | 20 ml |
* Plant Direct Lysis Buffer B minangka reagen opsional, sing digunakake kanggo netralake Plant Direct Lysis Buffer A kanggo ndawakake wektu panyimpenan sampel.Bisa digunakake miturut kahanan nyata.
Kahanan Panyimpenan
2 × Plant Direct Master Mix, simpen ing -30 ~ -15 ℃ lan supaya pembekuan lan thawing bola-bali;Buffer Lysis Langsung Tanduran, simpen ing -30 ~ -15 ℃ utawa 2 ~ 8 ℃.
Proses Eksperimen
Pangolahan Sampel–Godhong Tanduran
Metode langsung:Disaranake nggunakake godhong enom.Gunakake punch bolongan kanthi diameter tetep 0,5 - 3 mm kanggo entuk sampel cilik lan seragam, banjur langsung nambahake sampel menyang sistem PCR (sistem 50 μl dianjurake).Wigati, priksa manawa sampel ana ing solusi PCR lan ora ing tembok tabung.Yen PCR langsung digunakake kanggo nggedhekake pecahan dawa lan conto kompleks, nggunakake sampel kanthi diameter cilik (0,5 - 1 mm) minangka cithakan bisa mbantu entuk asil sing luwih apik.
Metode lysis grinding:Disaranake nggunakake godhong enom.Njupuk sepotong godhong cilik (diametere kira-kira 1 – 3 mm), lebokake ing 20 μl Plant Direct Lysis Buffer Ab, lan digiling sabisane (langkah iki bisa ditindakake kanthi meremas godhong nganggo ujung pipet 100 μl. kanggo mash sampel).Yen volume jaringan godhong sing luwih gedhe digunakake (ora ngluwihi 7 mm), tambahake volume buffer pengenceran nganti 50 μl.Sawise godhong lemah, solusi kasebut kudu katon ijo.Sawise sentrifugasi singkat, tambahake 1 μl supernatant menyang sistem PCR minangka template reaksi.
Metode lisis termal:Disaranake nggunakake godhong enom.Njupuk potongan cilik saka godhong (kira-kira 1 – 3 mm diameteripun), lebokake ing 20 μl Plant Direct Lysis Buffer A, lan panas ing 95 ° C kanggo 5 - 10 menit.Wektu lisis bisa ditambah kanthi tepat kanggo godhong sing angel lyse (ora luwih saka 20 menit).Yen volume jaringan godhong sing luwih gedhe digunakake (ora ngluwihi 7 mm), tambahake volume buffer pengenceran nganti 50 μl.Sawise dadi panas, centrifuge sedhela, lan tambahake 1 μl supernatant menyang sistem PCR minangka template reaksib.
Pangolahan Sampel– Wiji Tanduran
Metode lysis grinding:Gunakake scalpel kanggo ngethok wiji kanthi diameter 5 mm, ditambahake menyang 100 μl Plant Direct Lysis Buffer A, lan tlatah sampel kanthi tip pipette utawa alat liyane.Vortex sedhela lan supaya ngadeg ing suhu kamar kanggo 3 - 5 menit.Priksa manawa sampel wiji wis tenggelam ing buffer pengenceran.Sawise sentrifugasi singkat, tambahake 1 μl supernatant menyang sistem PCR minangka cithakan reaksi.
Metode lisis termal:Gunakake scalpel kanggo ngethok wiji kanthi diameter 5 mm, ditambahake ing 100 μl Plant Direct Lysis Buffer A, lan panas ing 95 ° C suwene 5 - 10 menit.Wektu lisis bisa ditambah kanthi tepat kanggo godhong sing angel lyse (ora luwih saka 30 menit).Sawise dadi panas, centrifuge sedhela, lan nambah 1 μl supernatant menyang sistem PCR minangka template reaksi b.
a.Gunting utawa alat liyane uga bisa digunakake kanggo ngethok conto ukuran sing cocog;yen pukulan utawa gunting digunakake maneh, kudu di resiki nganggo larutan natrium hipoklorit 2% sadurunge saben digunakake kanggo nyegah kontaminasi silang antarane conto.
b.Priksa manawa Plant Direct Lysis Buffer wis ilang sadurunge digunakake.Yen buffer punika kenthel utawa wis precipitates, bisa digawe panas ing 37 ℃ kanggo nyawiji rampung sadurunge digunakake.
c.Volume saka cithakan ing sistem reaksi bisa diatur jumbuh miturut prabédan ing volume bahan tanduran lan diluent ditambahaké.
Tanduran Langsung Lysis Buffer
The Plant Direct Lysis Buffer A sing ana ing prodhuk iki wis dioptimalake kanthi ketat kanggo ngeculake genom jaringan tanduran lan cocok kanggo panyimpenan jangka pendek tanduran mentah ing suhu 4 ℃.Yen sampel kudu disimpen kanggo wektu maneh (contone, 1 - 2 sasi), dianjurake kanggo mindhah supernatant menyang tabung EP anyar lan nyimpen ing -20 ℃.Kanggo nyimpen conto sing luwih stabil, tambahake volume sing padha saka Plant Direct Lysis Buffer B menyang supernatan sing ditransfer, aduk kanthi becik lan simpen ing -20 ℃.Wektu panyimpenan stabil beda-beda gumantung karo conto tanduran lan negara.
Sistem Reaksi
| ddH2O | Iki 20,0 µl | Iki 50,0 µl |
| 2 × Tanduran Langsung Master Mixa | 10,0 µl | 25,0 µ |
| Primer 1 (10 µM) | 0,8 µl | 2,0 µl |
| Primer 2 (10 µM)b | 0,8 µl | 2,0 µl |
| Sampel daun tetuwuhan/ekstrak mentah(Waca Pangolahan Sampel) | cakram godhong 0,5 – 3 mm/x µl | cakram godhong 0,5 – 3 mm/x µl |
a.Isine Mg2+ing konsentrasi pungkasan 2 mM.
b.Disaranake nggunakake konsentrasi pungkasan 0,4μM kanggo saben primer.Panggunaan primer sing berlebihan bakal nyebabake amplifikasi nonspesifik.
c.Jumlah sampel sing digunakake bisa diatur miturut kahanan nyata.Jumlah sing digunakake ing reaksi siji sampel lysed crude bisa diatur antarane 2% - 20% saka total volume reaksi.Nggunakake conto sing akeh banget bisa nyebabake kegagalan amplifikasi.
Program Reaksi
| Langkah-langkah | Suhu | Wektu |
| Denaturasi wiwitan | 98 ℃ | 5 min |
| Denaturasi | 95 ℃ | 10 sek |
| Annealing | 58 ~ 72 ℃ | 15 sek |
| Ekstensi | 72 ℃ | 30 sek |
| Ekstensi Akhir | 72 ℃ | 5 min |
a.Denaturasi Awal (98 ℃, 5 menit) ningkatake lisis jaringan tanduran, ngeculake DNA genom sing bisa digunakake kanggo amplifikasi PCR.Aja nyepetake wektu utawa nyuda suhu.
b.Disaranake nyetel padha karo nilai Tm sepisanan utawa 2 ~ 4 ℃ luwih dhuwur tinimbang nilai Tm.Polimerase DNA amplifikasi langsung sing digunakake ing produk iki beda karo polimerase DNA Taq konvensional, lan nduweni syarat khusus kanggo suhu anil reaksi; panggunaan suhu anil sing dhuwur bisa nyuda amplifikasi nonspesifik kanthi efektif lan ningkatake efisiensi amplifikasi.Kanggo cithakan kompleks, amplifikasi sing efisien bisa digayuh kanthi nyetel suhu anil lan ndawakake wektu ekstensi.
c.Yen dawa produk amplifikasi ≤1 kb, wektu extension disetel ing 30 sec/kb;yen dawa produk amplifikasi> 1 kb, wektu extension disetel ing 60 sec/kb.
d.Kanggo conto kompleks utawa conto sing ngasilake amplifikasi sing sithik, jumlah siklus bisa ditambah kanthi tepat dadi 40 -50 siklus.
Aplikasi
Iki ditrapake kanggo amplifikasi langsung jaringan tanduran lan screening dhuwur-throughput saka conto tanduran sing ora ngemot polisakarida lan polifenol.
Cathetan
Kanggo nggunakake riset mung.Ora digunakake ing prosedur diagnostik.
1. Kanggo amplifikasi tanduran mentah utawa amplifikasi langsung, disaranake nggunakake DNA genomik sing diresiki minangka kontrol positif sadurunge miwiti eksperimen kanggo mesthekake yen sistem, primer lan operasi bener.
2. Polimerase DNA amplifikasi langsung sing digunakake ing kit iki nduweni aktivitas proofreading sing kuwat.Yen kloning TA kudu ditindakake, dianjurake kanggo ngresiki DNA sadurunge nambahake adenine.
3. Pedoman Desain Primer:
a.Disaranake yen basa pungkasan ing mburi 3' primer kudu G utawa C.
b.Consecutive mismatches kudu nyingkiri ing pungkasan 8 basa ing 3′ mburi primer.c.Aja struktur jepit rambut ing mburi 3′ primer.
d.Bedane nilai Tm saka primer maju lan primer mbalikke kudu ora luwih saka 1 ℃ lan nilai Tm kudu disetel dadi 60 ~ 72 ℃ (Primer Premier 5 dianjurake kanggo ngetung nilai Tm).
e.Urutan sepisanan tambahan ekstra sing ora cocog karo cithakan, ngirim ora kalebu nalika ngetung Nilai Tm sepisanan.
f.Disaranake isi GC saka primer dadi 40% -60%.
g.Distribusi sakabèhé A, G, C lan T ing sepisanan kudu sabisane.Aja nggunakake wilayah kanthi konten GC utawa AT sing dhuwur.
h.Aja ana urutan komplementer saka 5 basa utawa luwih ing jero primer utawa ing antarane rong primer lan aja ana urutan komplementer saka 3 utawa luwih basa ing mburi 3' saka rong primer.
i.Gunakake fungsi NCBI BLAST kanggo mriksa kekhususan primer kanggo nyegah amplifikasi nonspesifik.
