Proteinase K NGS (bubuk)
Cat Nomer: HC4507A
NGS Protease K minangka protease serine sing stabil kanthi aktivitas enzim sing dhuwur lan kekhususan substrat sing amba. Enzim kasebut luwih seneng ngurai ikatan ester lan ikatan peptida ing jejere terminal C asam amino hidrofobik, asam amino sing ngandhut sulfur lan asam amino aromatik.Dadi, asring digunakake kanggo ngrusak protein dadi peptida cendhak.NGS Protease K minangka protease serine khas karo Asp39- Kang69-Ser224triad katalitik sing unik kanggo protease serin, lan pusat katalitik diubengi dening derek Ca.2+situs naleni kanggo stabilisasi, njaga aktivitas enzim dhuwur ing sawetara kahanan luwih akeh.
Spesifikasi
| Penampilan | Wêdakakêna amorf putih nganti putih-putih, lyophilized |
| Kegiatan tartamtu | ≥40U/mg padatan |
| DNase | Ora ana sing dideteksi |
| RNase | Ora ana sing dideteksi |
| Beban hayati | ≤50CFU/g padatan |
| Sisa asam nukleat | <5 pg/mg padat |
Properti
| Sumber | Album Tritirachium |
| nomer EC | 3.4.21.64(Rekombinan saka album Tritirachium) |
| Bobot molekul | 29kDa (SDS-PAGE) |
| Titik isoelektrik | 7.81 Gambar.1 |
| pH optimal | 7.0-12.0 (Kabeh nindakake aktivitas dhuwur) Fig.2 |
| Suhu paling optimal | 65 ℃ Gambar.3 |
| Stabilitas pH | pH 4,5-12,5 (25℃,16h) Gambar.4 |
| Stabilitas termal | Ing ngisor 50 ℃ (pH 8.0, 30min) Fig.5 |
| Stabilitas panyimpenan | Disimpen ing 25 ℃ kanggo 12 sasi Fig.6 |
| Aktivator | SDS, urea |
| Inhibitor | diisopropil fluorofosfat;benzylsulfonyl fluoride |
Kahanan Panyimpenan
Simpen bubuk lyophilized ing -25 ~ -15 ℃ kanggo dangu adoh saka cahya;Sawise pembubaran, aliquot menyang volume cocok kanggo panyimpenan short-term ing 2-8 ℃ adoh saka cahya utawa long-term panyimpenan ing -25 ~ -15 ℃ adoh saka cahya.
Cegahan
Nganggo sarung tangan lan kaca tingal protèktif nalika nggunakake utawa nimbang, lan supaya ventilasi apik sawise digunakake.Produk iki bisa nyebabake reaksi alergi kulit lan iritasi mata sing serius.Yen dihirup, bisa nyebabake alergi utawa gejala asma utawa dyspnea.Bisa nyebabake gangguan ambegan.
Definisi unit
Siji unit NGS Protease K ditetepake minangka jumlah enzim sing dibutuhake kanggo nghidrolisis kasein dadi 1 μmol L-tirosin ing kondisi penentuan standar.
Persiapan reagen
| Reagen | Produsen | Katalog |
| Kasein teknissaka susu sapi | Sigma Aldrich | C7078 |
| NaOH | Sinopharm KimiaReagent Co., Ltd. | 10019762 |
| NaH2PO4· 2H2O | Sinopharm KimiaReagent Co., Ltd. | 20040718 |
| Na2HPO4 | Sinopharm KimiaReagent Co., Ltd. | 20040618 |
| Asam trichloroacetic | Sinopharm KimiaReagent Co., Ltd. | 80132618 |
| Natrium asetat | Sinopharm KimiaReagent Co., Ltd. | 10018818 |
| Asam asetat | Sinopharm KimiaReagent Co., Ltd. | 10000218 |
| HCl | Sinopharm KimiaReagent Co., Ltd. | 10011018 |
| Sodium karbonat | Sinopharm KimiaReagent Co., Ltd. | 10019260 |
| Foline-phenol | Sangon Biotech (Shanghai)Co., Ltd. | A500467-0100 |
| L-tirosin | Sigma | 93829 |
Reagen I:
Substrat: 1% Casein saka solusi susu sapi: dissolve 1g susu sapi kasein ing 50ml saka 0,1M larutan natrium fosfat, pH 8,0, panas ing adus banyu ing 65-70 °C kanggo 15mins, nglakoake lan dissolve, adhem karo banyu, diatur dening natrium hidroksida nganti pH 8,0, lan diencerke nganti 100ml.
Reagen II:
Solusi TCA: 0.1M asam trichloroacetic, 0.2M natrium asetat lan 0.3M asam asetat (timbang 1.64g asam trikloroasetat + 1.64g natrium asetat + 1.724mL asam asetat berturut-turut, nambah 50mL banyu deionisasi, nyetel pH lan 4.HCl3 kanggo HCl3. 100 ml).
Reagen III:
0,4m larutan natrium karbonat (bobot 4,24g natrium karbonat anhidrat lan larut ing 100mL banyu)
Reagen IV:
Reagen fenol folin: diencerke 5 kali nganggo banyu deionisasi.
Reagen V:
Enzim pengencer: 0,1 M larutan natrium fosfat, pH 8,0.
Reagen VI:
Solusi standar L-tirosin: 0, 0,005, 0,025, 0,05, 0,075, 0,1, 0,25 umol / ml L-tirosin larut karo 0,2M HCl.
tata cara
1. Uripake spektrofotometer UV-Vis banjur pilih pangukuran fotometri.
2. Setel dawa gelombang minangka 660nm.
3. Nguripake adus banyu, nyetel suhu kanggo 37 ℃, mesthekake suhu ora owah kanggo 3-5mins.
4. Preheat landasan 0.5mL ing tabung centrifuge 2mL ing adus banyu 37 ℃ kanggo 10mins.
5. Extract 0.5mL solusi enzim diencerke menyang tabung centrifuge preheated kanggo 10 menit.Setel pelarut enzim minangka klompok kosong.
6. Tambah 1,0 mL reagen TCA sanalika sawise reaksi.Nyampur kanthi becik lan inkubasi ing adus banyu nganti 30 menit.
7. Solusi reaksi centrifugate.
8. Tambah komponen ing ngisor iki ing urutan kasebut.
| Reagen | Volume |
| Supernatan | 0,5 ml |
| 0,4 M natrium karbonat | 2,5 ml |
| Reagen folin fenol | 0,5 ml |
9. Nyampur uga sadurunge inkubasi ing adus banyu 37 ℃ kanggo 30 menit.
10. OD660ditemtokake minangka OD1;klompok kontrol blank: Enzim pengencer digunakake kanggo ngganti solusi enzim kanggo nemtokake OD660minangka OD2, ΔOD = OD1-OD2.
11. Kurva standar L-tirosin: 0.5mL konsentrasi beda L-tirosin solusi, 2.5mL 0.4M Sodium karbonat, 0.5mL Folin reagen phenol ing 5mL tabung centrifuge, incubate ing 37 ℃ kanggo 30mins, ndeteksi kanggo OD660kanggo konsentrasi L-tirosin sing beda, banjur entuk kurva standar Y=kX+b, ing ngendi Y yaiku konsentrasi L-tirosin, X yaiku OD600.
Petungan
2: Volume total larutan reaksi (mL)
0,5: Volume larutan enzim (mL)
0.5: Volume cairan reaksi sing digunakake ing penentuan kromogenik (mL)
10: Wektu reaksi (min)
Df: Dilution kaping
C: Konsentrasi enzim (mg/mL)
Angka
Fig.1 residu DNA
| Sampel | Ave C4 | Asam Nukleat Recovery (pg/mg) | Recovery(%) | Nukleat Total asam ( pg/mg) |
| PRK | 24.66 | 2.23 | 83% | 2.687 |
| PRK+STD2 | 18.723 | 126.728 | — | — |
| STD1 | 12.955 |
— |
— |
— |
| STD2 | 16 | |||
| STD3 | 19.125 | |||
| STD4 | 23.135 | |||
| STD5 | 26.625 | |||
| H2O Bebas RNA | Ora ditemtokake | — | — | — |
Gbr.2 pH optimal
Fig.3 Suhu paling luweh
Gbr.4 Stabilitas pH
Fig.5 Stabilitas termal
Fig.6 Stabilitas panyimpenan ing 25 ℃
