2×Sensi Direct Premix-UNG (Probe qPCR)
Cat Nomer: HCB5151A
SensiDirect Premix-UNG (Probe qPCR) dirancang kanggo nindakake PCR langsung saka sampel tanpa ekstraksi DNA utawa persiapan sampel.Reagen iki kasusun saka hot-start DNA polymerase, uracil DNA glycosylase (UNG), RNase Inhibitor, MgCl2, dNTP (karo dUTP tinimbang dTTP), lan stabilisator, kanggo PCR kuantitatif (qPCR).Reagen iki preforms toleransi inhibitor dhuwur, lan kanthi mangkono bisa langsung Applied kanggo deteksi conto kaya swab tenggorokan, saliva, anti-coagulated getih wutuh, plasma, lan serum tanpa extraction DNA.Reagen nggunakake buffer proprietary kanggo qPCR kanthi enzim campuran polimerase DNA anti-inhibitor lan enzim UNG.Mula, bisa entuk amplifikasi gen target sing apik ing conto sing ngemot inhibitor lan nyegah amplifikasi positif palsu sing disebabake dening polusi residual PCR lan aerosol.Reagen iki kompatibel karo paling instrumen PCR kuantitatif fluoresensi, kayata Applied Biosystems, Eppendorf, Bio-Rad, Roche lan liya-liyane.
Komponen
1. 50×SensiDirect Enzim/UNG Mix
2. 2×SensiDirect Premix Buffer (dUTP)
Kondisi panyimpenan
Kabeh komponen kudu disimpen ing -20 ℃ kanggo panyimpenan jangka panjang lan 4 ℃ nganti 3 sasi.Mangga nyampur sak tenane sawise thawing lan centrifuge sadurunge nggunakake.Aja kerep beku-thaw.
Protokol Cycling
| Langkah | Suhu | Wektu | Sepeda; Pit; ontel |
| Pencernaan | 50 ℃ | 2 min | 1 |
| Aktivasi polimerase | 95 ℃ | 1-5min | 1 |
| Denatur | 95 ℃ | 10-20s | 40-50 |
| Annealing / Extension | 56-64 ℃ | 20-60s |
Pipetting Instruksi
| Reagen | Volume per reaksi | Volume saben reaksi | Konsentrasi pungkasan |
| 2×SensiDirect Premix Buffer (dUTP) | 12,5µL | 25µL | 1× |
| 50×SensiDirect Enzim/UNG Mix | 0,5µL | 1µL | 1× |
| 25×Primer-Probe Mix1, 2 | 1µL | 2µL | 1× |
| Sampel3, 4 | - | - | - |
| ddH2O | - | - | - |
| Volume total | 25 μl | 50 μL | - |
1. Konsentrasi pungkasan primer biasane 0,2μM.Kanggo asil sing luwih apik, konsentrasi primer bisa dioptimalake ing kisaran 0.2-1μM.
2. Umumé, konsentrasi probe bisa dioptimalake ing kisaran 0.1-0.3μM.Konsentrasi optimal probe ana gandhengane karo instrumen amplifikasi PCR wektu nyata, jinis probe, lan jinis zat label fluoresensi.Mangga deleng manual instrumen utawa syarat khusus saben probe fluoresensi.
3. Jinis-jinis sampel sing beda-beda ngemot macem-macem jinis lan isi inhibitor lan nomer salinan gen target.Volume sampel kudu dianggep miturut kondisi nyata.Nggawe pengenceran sampel kanthi nambahake banyu tanpa nuklease utawa TE Buffer, yen perlu.
4. Dianjurake volume sampel beda:
| Sampel | Volume siji 50 μL reaksi | maksimal rasio |
| Anticoagulated getih wutuh | 2,5 l | 5% |
| Plasma | 15 μL | 30% |
| Serum | 10 μL | 20% |
| Sapuan tenggorokan | 10 μL | 20% |
| idu | 10 μL | 20% |
Kontrol kualitas
1. Deteksi fungsi: sensitivitas, specificity lan repeatability saka qPCR.
2. Ora ana aktivitas nuklease eksogen: ora ana endonuklease eksogen lan polusi eksonuklease.
Cathetan saka produk
1. Produk iki nggunakake jinis anyar saka polimerase DNA wiwitan panas, sing bisa diaktifake ing menit 1-5. Wiwit buffer reaksi wis dioptimalake, luwih cocok kanggo PCR kuantitatif fluoresensi kaping pindho utawa kaping nggunakake metode probe.
2. Yen nilai Rn saka amplifikasi PCR kurang banget utawa amplifikasi temenan nyandhet, ngurangi jumlah sampel, nambah volume reaksi utawa pengenceran sadurungé saka sampel bisa nambah asil.
3. Koleksi getih, saliva, cipratan, swab tenggorokan, lan liya-liyane kudu ngetutake syarat kritéria klinis, lan sampel seger bisa digunakake kanggo nyegah degradasi asam nukleat.
4. Wiwit amplicons beda duwe efficiency pemanfaatan beda kanggo dUTP lan sensitivitas kanggo UNG, reagen kudu optimized yen sensitivitas deteksi sudo nalika nggunakake sistem UNG.Hubungi kita kanggo dhukungan teknis yen perlu.
5. Kanggo ngindhari amplifikasi produk PCR ing antarane reaksi siji-langkah, area eksperimen khusus lan pipette dibutuhake kanggo amplifikasi.Operasi nganggo sarung tangan lan ganti kanthi kerep lan aja mbukak tabung reaksi sawise amplifikasi PCR.
