Proteinase K mNGS (cair)
Proteinase K minangka protease serine sing stabil kanthi spesifik substrat sing amba.Iku ngrusak akeh protein ing negara asli sanajan ana deterjen.Bukti saka studi struktur kristal lan molekul nuduhake enzim kasebut kalebu kulawarga subtilisin kanthi triad katalitik situs aktif (Asp).39- Kang69-Ser224).Situs utama pembelahan yaiku ikatan peptida sing cedhak karo gugus karboksil saka asam amino alifatik lan aromatik kanthi gugus amino alfa sing diblokir.Biasane digunakake kanggo spesifik sing amba.Protease K iki dirancang khusus kanggo mNGS.Dibandhingake karo proteinase K liyane, ngemot kontaminasi asam nukleat sing luwih sithik kanthi kinerja enzim sing padha, sing bisa njamin aplikasi mNGS hilir.
Kahanan Panyimpenan
2-8 ℃ kanggo 2 taun
Spesifikasi
| Penampilan | Cairan ora ana warna nganti coklat entheng |
| Kegiatan | ≥800 U/ml |
| Konsentrasi protein | ≥20 mg/ml |
| Nickase | Ora ana sing dideteksi |
| DNase | Ora ana sing dideteksi |
| RNase | Ora ana sing dideteksi |
Properti
| nomer EC | 3.4.21.64(Rekombinan saka album Tritirachium) |
| Titik isoelektrik | 7.81 |
| pH optimal | 7.0-12.0 Gambar 1 |
| Suhu paling optimal | 65 ℃ Gambar 2 |
| stabilitas pH | pH 4,5-12,5 (25 ℃, 16 jam) Gambar 3 |
| Stabilitas termal | Ing ngisor 50 ℃ (pH 8,0, 30 min) Gambar 4 |
| Stabilitas panyimpenan | Swara 90% aktivitas kanggo 12 sasi ing 25 ℃ |
| Aktivator | SDS, urea |
| Inhibitor | diisopropil fluorofosfat;fenilmetilsulfonil fluorida |
Aplikasi
1. Kit diagnostik genetik
2. Kit ekstraksi RNA lan DNA
3. Ekstraksi komponen non-protein saka jaringan, degradasi impurities protein, kayata DNAvaksin lan persiapan heparin
4. Preparation DNA kromosom dening elektroforesis pulsed
5. Blot Kulon
6. Reagen albumin glikosilasi enzimatik ing diagnosis vitro
Cegahan
Nganggo sarung tangan lan kaca tingal protèktif nalika nggunakake utawa nimbang, lan supaya ventilasi apik sawise digunakake.Produk iki bisa nyebabake reaksi alergi kulit lan iritasi mata sing serius.Yen dihirup, bisa nyebabake alergi utawa gejala asma utawa dyspnea.Bisa nyebabake gangguan ambegan.
Definisi unit
Siji unit (U) ditetepake minangka jumlah enzim sing dibutuhake kanggo hidrolisis kasein kanggo ngasilake 1 μmoltirosin saben menit ing kondisi ing ngisor iki.
Persiapan reagen
Reagen I: 1g susu kasein dibubarake ing 50ml larutan natrium fosfat 0,1M (pH 8,0), diinkubasi ing banyu 65-70 ℃ suwene 15 menit, diaduk lan dibubarake, digawe adhem kanthi banyu, diatur natrium hidroksida dadi pH 8,0, lan volume tetep 100 ml.
Reagen II: asam trikloroasetat 0,1M, natrium asetat 0,2M, asam asetat 0,3M.
Reagen III: 0,4M Na2CO3solusi.
Reagen IV: Reagen forint diencerke karo banyu murni kanggo 5 kaping.
Reagen V: Enzim pengencer: 0,1M larutan natrium fosfat (pH 8,0).
Reagen VI: larutan tirosin: 0, 0,005, 0,025, 0,05, 0,075, 0,1, 0,25 umol/ml tirosin larut karo 0,2M HCl.
tata cara
1. 0.5ml saka reagen I wis wis warmed kanggo 37 ℃, nambah 0.5ml saka solusi enzim, nyampur uga, lan inkubasi ing37 ℃ kanggo 10 menit.
2. Tambah 1ml reagen II kanggo mungkasi reaksi, nyampur uga, lan terus inkubasi kanggo 30mins.
3. Solusi reaksi centrifugate.
4. Ambil supernatan 0,5 ml, tambahkan 2,5 ml reagen III, 0,5 ml reagen IV, aduk rata dan inkubasi pada suhu 37 ℃kanggo 30 menit.
5. OD660ditemtokake minangka OD1;klompok kontrol kosong: 0,5ml reagen V digunakake kanggo ngganti enzimsolusi kanggo nemtokake OD660minangka OD2, ΔOD = OD1-OD2.
6. Kurva standar L-tirosin: 0.5mL konsentrasi beda larutan L-tirosin, 2.5mL Reagen III, 0.5mL Reagen IV ing tabung centrifuge 5mL, inkubasi ing 37 ℃ kanggo 30 menit, ndeteksi kanggo OD660kanggo konsentrasi L-tirosin sing beda, banjur entuk kurva standar Y=kX+b, ing ngendi Y yaiku konsentrasi L-tirosin, X yaiku OD600.
Petungan
2: Volume total larutan reaksi (mL)
0,5: Volume larutan enzim (mL)
0.5: Volume cairan reaksi sing digunakake ing penentuan kromogenik (mL)
10: Wektu reaksi (min)
Df: Dilution kaping
C: Konsentrasi enzim (mg/mL)
Referensi
1. Wieger U & Hilz H. FEBS Lett.(1972);23:77.
2. Wieger U & Hilz H. Biochem.Biofisika.Res.Commun.(1971);44:513.
3. Hilz, H.et al.,Eur.J. Biokimia.(1975);56:103–108.
4. Sambrook Jet al., Kloning Molekul: A Laboratory Manual, 2nd edition, Cold Spring HarborLaboratory Press, Cold Spring Harbor (1989).
Angka
Gbr.1 Optimal pH
Solusi buffer 100mM: pH6.0-8.0, Na-fosfat;pH8,0-9,0, Tris-HCl;pH9.0-12.5, Glycine-NaOH.Konsentrasi enzim:1mg/mL
Fig.2 Suhu paling luweh
Reaksi ing 20 mM K-fosfat buffer pH 8,0.Konsentrasi enzim: 1 mg/mL
Gambar.3 pH Stabilitas
25 ℃, 16 h-perawatan kanthi larutan buffer 50 mM: pH 4,5- 5,5, Asetat;pH 6.0-8.0, Na-fosfat;pH 8.0-9.0, Tris-HCl.pH 9,0-12,5, Glycine-NaOH.Konsentrasi enzim: 1 mg/mL
Fig.4 Thermal stabilitas
30 menit-perawatan karo 50 mM Tris-HCl buffer, pH 8,0.Konsentrasi enzim: 1 mg/mL
Fig.5 Panyimpenan stability at 25 ℃
