Hotstart Taq DNA Polimerase
Hot Start Taq DNA Polymerase (modifikasi Antibodi) yaiku polimerase DNA termostabil wiwitan panas saka Thermus aquaticus YT-1, sing nduweni aktivitas polimerase 5′→3′ lan aktivitas endonuklease flap 5′.Hot-start Taq DNA polymerase yaiku Taq DNA polymerase sing diowahi dening antibodi Taq thermolabile.Modifikasi antibodi nambah spesifik, sensitivitas, lan ngasilake PCR.
Komponen
| Komponen | HC1012A-01 | HC1012A-02 | HC1012A-03 | HC1012A-04 |
| 5 × HC Taq Buffer | 4 × 1 ml | 4 × 10 ml | 4 × 50 ml | 5 × 400 ml |
| Hot Start Taq DNA Polymerase (Dimodifikasi Antibodi) (5 U/μL) | 0,1 ml | 1 ml | 5 ml | 10 × 5 ml |
Aplikasi
10 mM Tris-HCl (pH 7,4 ing 25 ℃), 100 mM KCl, 0,1 mM EDTA, 1 mM dithiothreitol, 0,5% Tween20, 0,5% IGEPALCA-630 lan 50% Gliserol.
Kondisi panyimpenan
Transportasi ing ngisor 0 ° C lan disimpen ing -25 ° C ~ -15 ° C.
Definisi Unit
Siji unit ditetepake minangka jumlah enzim sing nggabungake 15 nmol dNTP dadi bahan sing ora larut asam sajrone 30 menit ing suhu 75 ° C.
Kontrol kualitas
1.EndAktivitas onuclease:Inkubasi 20 U enzim kanthi 4 μg pUC19 DNA sajrone 4 jam ing suhu 37 ℃ ora nyebabake degradasi DNA sing bisa dideteksi kaya sing ditemtokake dening elektroforesis gel.
2.5 kb Lambda PCR:25 Siklus amplifikasi PCR saka 5 ng Lambda DNA kanthi 1,25 unit Taq DNA Polymerase ing ngarsane 200 µM dNTP lan 0,2 µM primer ngasilake produk 5 kb sing dikarepake.
3.Aktivitas Eksonuklease:Inkubasi reaksi 50 µl ngemot minimal 12,5 U saka Taq DNA Polymerase kanthi 10 nmol 5'-FAM oligonucleotide sajrone 30 menit ing 37 ℃ ora ngasilake degradasi sing bisa dideteksi.
4.Aktivitas RNase:Inkubasi reaksi 10 µL sing ngemot 20 U enzim kanthi 1μg transkrip RNA sajrone 2 jam ing suhu 37 ° C ora nyebabake degradasi RNA sing bisa dideteksi kaya sing ditemtokake dening elektroforesis gel.
5.Inactivation panas:Ora.
Sistem Reaksi
| Komponen | Volume |
| Cithakan DNAa | opsional |
| Primer Maju 10 μM | 0,5 μL |
| 10 μM Reverse Primer | 0,5 μL |
| Campuran dNTP (masing-masing 10mM) | 0,5 μL |
| 5 × HC Taq Buffer | 5 μl |
| Taq DNA Polimeraseb(5U/μL) | 0,125 μL |
| Banyu tanpa nuklir | Iki 25 μL |
Cathetan:
1) a.
| DNA | Jumlah |
| Genomik | 1 ng-1 μg |
| Plasmid utawa Viral | 1 pg-1 ng |
2) b.Konsentrasi optimal Taq DNA Polymerase bisa uga beda-beda saka 5-50 unit/mL (0.1-0.5 unit/25 µL reaksi) ing aplikasi khusus.
Protokol siklus termal
PCR
| Langkah | Suhu(°C) | Wektu | Siklus |
| Denaturasi wiwitana | 95 ℃ | 1-3min | - |
| Denaturasi | 95 ℃ | 15-30 s | 30-35 Siklus |
| Annealingb | 45-68 ℃ | 15-60 s | |
| Ekstensi | 68 ℃ | 1 kb/min | |
| Ekstensi Akhir | 68 ℃ | 5 menit | - |
Cathetan:
1) Denaturasi awal 1 menit ing 95 ° C cukup kanggo umume amplifikasi.Kanggo cithakan sing angel, denaturasi luwih dawa 2-3 menit ing 95 ° C dianjurake.Kanthi PCR koloni, denaturasi awal 5 menit ing 95 ° C dianjurake.
2) Langkah annealing biasane 15-60 s.Suhu Annealing adhedhasar Tm saka pasangan primer lan biasane 45-68 ℃.
